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WB實(shí)驗(yàn)方案

發(fā)布時(shí)間: 2023-10-17  點(diǎn)擊次數(shù): 1271次
蛋白免疫印跡(Western blotting)一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測(cè)三個(gè)部分組成。第一步是通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)混合物按分子量大小在凝膠中分成條帶
蛋白免疫印跡(Western blotting)一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測(cè)三個(gè)部分組成。第一步是通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)混合物按分子量大小在凝膠中分成條帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上,使用較多的是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜,蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移。第三步是用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的目標(biāo)抗原。免疫檢測(cè)的方法可以是直接的和間接的?,F(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法,在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后,再用酶標(biāo)的第二抗體(堿性磷酸酶(AP)或辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗雜交結(jié)合,再加酶的底物顯色或者通過(guò)膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來(lái)顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)中。
 
一、操作步驟:
 
1. 蛋白樣品制備
 
(1)單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/div>
 
①倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。
 
②每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS(0.01 M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動(dòng)1 min 洗滌細(xì)胞,然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次,共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
 
③按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。)
 
④每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。
 
⑤裂解完后,用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動(dòng)作要快),然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml 離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。)
 
⑥于4℃下12000 rpm離心5 min 。(提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)
 
⑦將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 min 的離心管中放于-20℃保存。
 
(2)組織中總蛋白的提?。?/div>
 
①將少量組織塊置于1~2 ml 勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
 
②加400 ml單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中,進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
 
③幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上,要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
 
④裂解30 min后,即可用移液器將裂解液移至1.5 ml 離心管中,然后在4℃下12000 rpm 離心5 min ,取上清分裝于0.5 ml 離心管中并置于-20℃保存。
 
(3)加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/div>
 
由于受藥物的影響,一些細(xì)胞脫落下來(lái),所以除按(1)操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/div>
 
①將培養(yǎng)液倒至1.5 ml 離心管中,于2500 rpm 離心5 min。
 
②棄上清,加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500 rpm 離心5 min 。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
 
③用槍洗干上清后,加100 μl 裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min,裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
 
④將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm 離心5 min,取上清分裝于0.5 ml 離心管中并置于-20℃保存。
 
2. 蛋白含量的測(cè)定
 
(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
 
①?gòu)?20℃取出1 mg/ml BSA,室溫融化后,備用。
 
②取18個(gè)1.5 ml 離心管,3個(gè)一組,分別標(biāo)記為 0 μg,2.5 μg,5.0 μg ,10.0 μg ,20.0 μg ,40.0μg。
 
③按下表在各管中加入各種試劑。
 
0 μg 2.5 μg 5.0 μg 10.0 μg 20.0 μg 40.0 μg
1mg/ml BSA —— 2.5 μl 5.0 μl 10.0 μl 20.0 μl 40.0 μl
0.15mol/L NaCl 100 μl 97.5 μl 95.0 μl 90.0 μl 80.0 μl 60.0 μl
G250考馬斯亮藍(lán)溶液 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
 
④混勻后,室溫放置2 min 。在生物分光光度計(jì)(Bio-Photometer,Eppentoff)上比色分析。
 
(2)檢測(cè)樣品蛋白含量
 
①取足量的1.5 ml 離心管,每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml 。室溫放置30 min后即可用于測(cè)蛋白。
 
②取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 μl,混勻放置2分鐘可做為空白樣品,將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測(cè)空白樣品。
 
③棄空白樣品,用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5 ml),再用無(wú)菌水洗一次。
 
④取一管考馬斯亮藍(lán)加95 μl 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 μl待測(cè)蛋白樣品,混勻后靜置2 min,倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品。
 
注意:每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗2次,無(wú)菌水洗一次??赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè),這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是5 μl樣品含的蛋白量。
 
3. SDS-PAGE電泳
 
(1)清洗玻璃板:
 
一只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖,再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
 
(2)灌膠與上樣
 
①玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。(操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊,以免漏膠。)
 
②按前面方法配10%分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí),可用10 ml 槍吸取5 ml 膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水,液封后的膠凝的更快。(灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些,膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢,否則膠會(huì)被沖變型。)
 
③當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí),說(shuō)明膠已凝了。再等3 min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
 
④按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小,從而使加樣孔的上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
 
⑤用水沖洗一下濃縮膠,將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內(nèi),大玻璃板面向外。若只跑一塊膠,那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。)
 
⑥測(cè)完蛋白含量后,計(jì)算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml 離心管中,加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。(上樣總體積一般不超過(guò)15 μl,加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。
 
⑦加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。(電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。)用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,以免交叉污染。
 
(3)電泳
電泳時(shí)間一般4~5 h,電壓為40 V較好,也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
 
4. 轉(zhuǎn)膜
 
(1)轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0~8.3 cm的濾紙和1張7.3~8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套,因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。(用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里,膜與水之間形成一層空氣膜,這樣會(huì)阻止膜吸水。
 
(2)在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜。
 
(3)將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上),
一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。
 
(4)要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時(shí)候動(dòng)作要輕,要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng),直到撬去玻板。(撬時(shí)一定要小心,玻板很易裂。)除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作),要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上,用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上,要蓋滿整個(gè)膠(膜蓋下后不可再移動(dòng))并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊,搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會(huì)發(fā)生短路。(轉(zhuǎn)移液含甲醇,操作時(shí)要戴手套,實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通。)
 
(5)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中,要使夾的黑面對(duì)槽的黑面,夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱,在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。
 
(6)轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min(于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。   
 
5. 免疫反應(yīng)
 
(1)將膜用TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。
 
(2)將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度(在1.5 ml 離心管中);撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液后,將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min。
 
(3)同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
 
6. 化學(xué)發(fā)光,顯影,定影
 
(1)將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合;1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸;1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液,包好,放入X-光片夾中。
 
(2)在暗室中,將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中;在紅燈下取出X-光片,用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1 cm);打開(kāi)X-光片夾,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移動(dòng),關(guān)上X-光片夾,開(kāi)始計(jì)時(shí);根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間,一般為1 min或5 min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片,以達(dá)最佳效果;曝光完成后,打開(kāi)X-光片夾,取出X-光片,迅速浸入顯影液中顯影,待出現(xiàn)明顯條帶后,即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1~2 min(20~25℃),溫度過(guò)低時(shí)(低于16℃)需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間;顯影結(jié)束后,馬上把X-光片浸入定影液中,定影時(shí)間一般為5~10 min,以膠片透明為止;用自來(lái)水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干。
 
應(yīng)注意的是:顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí),盡量拿膠片一角,手指甲不要?jiǎng)潅z片,否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
 
7. 凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

 

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